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通過代謝酶抑制試驗評價供試品對CYP450、UGT、SULT或CES等主要亞酶的抑制作用,了解其直接抑制或時間依賴性抑制(TDI)作用情況,從而評價其可能的代謝性相互作用。
孵育體系 | 細胞組(zu)分:肝細胞 亞細胞組分:肝、腸(chang)、肺或腎等組織的微粒(li)體、S9或勻漿等 基因重組酶體系 |
種屬 | 人 |
測試酶系 | CYP450酶:CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A等 UGT酶:UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7和2B15等(deng) SULT酶:SULT1A1、1A2、1A3、1B1、1E1和(he)2A1等 CES酶(mei):CES1和CES2 其他:AADAC、FMO等其他酶(mei)或亞型可應要求提供 |
供試品測試濃度 | 5~7個,根據已知的藥效和毒性數(shu)據設計 |
探(tan)針底物濃度 | 1個或1-5個(直接抑制常數測定),根據探針底物Km值設計 |
孵育體系(xi)蛋白(bai)濃(nong)度(du) | 亞細胞組分:0.1-1 mg/mL(可根據要求提供不同的濃度) 細胞組分:0.1-2×106 cells/mL 基(ji)因重組酶體系:250 - 500 pmol/mL 或0.1-1 mg/mL |
孵育時間 | 直接抑制或TDI IC50 shift:一個預孵育時間點,一個孵育時間點 TDI KI和Kinact測定:預孵育2-5個時間(jian)點(dian),一(yi)個正式孵育時間點 根據不同要求提供 |
輔(fu)酶因子 | NADPH或UDPGA(其(qi)他輔酶(mei)因子可(ke)根據要求提供(gong)) |
分(fen)析方法 | LC-MS/MS |
數據呈現 | 探針底物(wu)代謝(xie)產物(wu)相對(dui)生成量 相(xiang)對活性(% of NC) 半數抑制濃度(du)(IC50) 抑制活性(%) IC50偏(pian)移 抑制常數(Ki) 最(zui)大失活速率常數(Kinact) 導致半數最大失(shi)活的游離抑制劑濃度(KI) |